BE1003298A3

BE1003298A3 - Werkwijze voor het bereiden van een enzymatisch hydrolysaat.

Info

Publication number: BE1003298A3
Application number: BE9000044A
Authority: BE
Inventors: Philippe R Bressollier; Raymond A Julien; Claude H Pejoan; Bernard G Verneuil; Pierre C Loosen
Original assignee: Tessenderlo Chem Nv
Priority date: 1990-01-12
Filing date: 1990-01-12
Publication date: 1992-02-18
Also published as: WO1991010369A1; EP0511970A1; US5356637A; ATE123925T1; EP0511970B1; DE69110663D1; JPH05505304A

Abstract

Men bereidt een enzymatisch hydrolysaat rijk aan di- en tripeptiden door een plasmatisch dierlijk eiwitmengsel, voorbereid door thermocoagulatie en vloeistof-vaste stof scheiding aan een enzymatische proteolyse te onderwerpen teneinde tenminste 50 gewichts % eiwitten om te zetten in een hydrolysaat dat minstens 75 % di- en tripeptiden bevat. Men extraheert het hydrolysaat rijk aan di- en tripeptiden door een vloeistof-vaste stof scheiding gevolgd door ultrafiltratie. Vervolgens onderwerpt men het hydrolysaat een sterilisatie- en een drogingsproces.

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  WERKWIJZE VOOR HET BEREIDEN VAN EEN ENZYMATISCH
HYDROLYSAAT 
De uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bereiden van een enzymatisch hydrolysaat, dat di-en tripeptiden bevat, uitgaande van een mengsel van dierlijke proteinen met behulp van proteolytische   enzymen.   



   Het fysiologisch belang van de darmabsorptie van de di-en tripeptiden is ongeveer dertien jaar geleden ontdekt geweest. Aldus, het bestaan van de darmtransportsystemen van kleine peptiden, verschillend van die van de vrije aminozuren, en de grootste efficiëntie van de absorptie als de voedingsaanvoer van proteinen geschiedt met mengsels verrijkt met kleine peptiden werden aangetoond door SLEISENGER et al in een artikel   getiteld "Evidence   for a single common carrier of uptake of a dipeptide and tripeptide by hamster jejunum in   vitro" gepubliceerd   in het   tijdschrift"Gastroenterology",   volume 71, blz. 76 tot 81 (1976). 



   Samenstellingen die rijk zijn aan di-en tripeptiden zijn van groot belang in de dieetleer niet alleen voor de voeding van jonge kinderen, herstellenden en anemiepatiënten, maar ook voor die van zieken waarvan de darmabsorptie gewijzigd is, zoals bij de ziekte van Hartnup of bij cystinurie. 



   Zowel bij de personen die aangetast zijn door de ziekte van Hartnup als bij diegenen die aangetast 

 <Desc/Clms Page number 2> 

 zijn door cystinurie, worden de aminozuren op een normale wijze geabsorbeerd door de darmmucose als ze onder de vorm van dipeptiden voorkomen. (Zie ASATOOR,   A. M.   HARRISON, B. D. W., MILNE, M. D. and PROSSER, D. l (1972). Intestinal absorption of arginine-containing peptide in cystinuria Gut (Journal of the British Society for Gastroentology) volume 13, blz. 95-98 (1970) en NAYAB, F. and ASATOOR,   A. M.   (1970). Studies on intestinal absorption of amino acids and a dipeptide in a case of Hartnup disease. Gut (Journal of the British Society for Gastroentology) volume 11, blz. 373-379 (1972). 



   De uitvinding vindt ook zijn toepassing in de ziekenhuissector, meer bepaald in de kunstmatige voeding die toegediend wordt via orale, enterale of parenterale weg, in het bijzonder via een intraveineuse infusie. 



   De kunstmatige voeding ligt voor de hand bij patiënten die onbekwaam zijn om zich via de normale weg te voeden wegens een lichamelijk letsel veroorzaakt door een ongeval, een chirurgische operatie, een slokdarmtrauma of wegens een algemene fysiologische toestand die geen normale voeding toelaat (coma, brandwonden). 



   Andere mogelijke toepassingen zijn de immunostimulatie of het gebruik in de dierlijke voeding, vooral in de visvoeding, of de aanwending als groeistimulator. 



   Men kent verscheidene methodes om mengsels van peptiden of om samenstellingen rijk aan di-en tripeptiden te bereiden nl. de alkalische of zure 

 <Desc/Clms Page number 3> 

 hydrolyse, de enzymatische hydrolyse en de chemische synthese. 



   De alkalische hydrolyse of de zure hydrolyse van eiwitten zoals lactalbumine, ovalbumine, lactoserum en   caseine   met behulp van sterke zuren of basen wordt bij hoge temperatuur gebruikt om de chemische bindingen te breken. De hydrolyse leidt tot de produktie van mengsels aanzienlijk verrijkt aan vrije aminozuren en dikwijls erg gecontamineerd door zouten (Cl-, Na+) die moeilijk te verwijderen zijn. 



   De gekende chemische methodes zijn gemakkelijk aan te wenden en laten toe om een hoge graad van hydrolyse te bekomen door splitsing van een groot aantal peptidebindingen. Zij zijn echter drastisch en brengen de vorming van secundaire, ongewenste reakties met zich mee evenals een vermindering van de voedingswaarde van de proteinen door de ontbinding van de essentiële aminozuren. 



   Aldus brengt de alkalische hydrolyse op een hoge temperatuur (100 tot   110 C)   dikwijls de vorming van lysinoalanine, een zeer toxisch bijprodukt, voort. Daarenboven is het moeilijk om de hydrolysegraad te controleren van het eindprodukt, dikwijls erg gecontamineerd door zouten    (Cl      Na+..).   



   Het dokument EP-A-0148072 beschrijft een proces van proteolyse   van'plasmatisch   eiwit voor de produktie van eiwithydrolysaten die geschikt zijn voor de menselijke en de dierlijke voeding dankzij hun aanvaardbaar aroma en smaak. In dit proces wordt het bloedplasma, dat gebruikt wordt als substraat 

 <Desc/Clms Page number 4> 

 voor de hydrolyse, verkregen door het centrifugeren van het gehele bloed opgevangen bij de slachting en met anticoagulens behandeld. Door centrifuge in een scheidingstoestel verkrijgt men een lichtgeel gekleurde fase, het plasma, en een dieprood gekleurde fase, de bloedcellen. 



   Men verwezenlijkt eerst een denaturatie van het plasma door een thermische behandeling van de eiwitten bij een temperatuur van 70 tot 100 C, waarbij de pH constant wordt gehouden tussen 5 tot 7 gedurende minder dan 30 minuten. 



   Vervolgens voert men de plasmatische eiwitproteolyse uit door het plasma toe te voegen aan een waterig reaktiemilieu dat thermolysine bevat in aanwezigheid van calciumionen met een pH van 5 tot 7 en bij een temperatuur kleiner of gelijk aan   80 C.   



   Bij een temperatuursbereik gelegen tussen 50 en   60 C   vermijdt men de vermenigvuldiging van mesofiele bacteriën. 



   De aanwending van de ultrafiltratietechniek is noodzakelijk bij het proces om het enzyme en de plasmatische eiwitten tegen te houden. Men recupereert het hydrolysaat in het permeaat van de ultrafiltratie en men circuleert opnieuw het retentaat naar de reactor. 



   De oordeelkundige keuze van enzymen en hydrolysevoorwaarden leidt tot het verkrijgen van peptiden met welbepaalde grootte volgens de behoeften. 

 <Desc/Clms Page number 5> 

 



   Het nadeel van de proteolyse in het algemeen ligt in de lage gewichtsopbrengst van di-en tripeptiden. De peptiden met meer dan drie aminozuren hebben de kinetische voordelen niet van de absorptie die hogervermeld beschreven werd. 



   Deze uitvinding betreft een werkwijze om een enzymatisch hydrolysaat te bereiden dat di-en tripeptiden bevat uitgaande van een mengsel van dierlijke eiwitten in aanwezigheid van proteolytische enzymen. Deze werkwijze is hoofdzakelijk gekenmerkt door het oorspronkelijk eiwitmengsel voor te bereiden door thermocoagulatie en een scheiding vloeistofneerslag. Men laat dit voorbereid mengsel een enzymatische hydrolyse ondergaan om op die manier meer dan 50 % aan gewicht van eiwitten om te zetten in di-en tripeptiden : men extraheert het hydrolysaat door middel van een scheiding vloeistof-vaste stof om het daarna te verrijken aan di-en tripeptiden door ultrafiltratie alvorens het te steriliseren en te drogen. 



   In een bijzondere werkwijze voor de uitvoering van het proces, voegt men aan het dierlijk bloed minder dan 4 g/l anticoagulens toe ; men centrifugeert het om zo een produkt te verkrijgen dat langer bruikbaar of geschikt is voor bewaring na bevriezing of na sproei-droging. Dit verkregen bloedplasma wordt na aanzuren thermisch behandeld binnen een temperatuursbereik gelegen tussen 70 tot   80    Celsius gedurende 30 tot 45 minuten. Vervolgens wordt het onderworpen aan een vloeistof-vaste stof scheiding door tangentiële microfiltratie, centrifugatie, filtratie onder druk of onderdruk (bij voorkeur op een persfilter), om op die manier een 

 <Desc/Clms Page number 6> 

 vast substraat te bekomen. Dit substraat wordt in suspensie gebracht en onderworpen aan een hydrolyse met proteolytische enzymen. 



   Men gebruikt als anticoagulens kalium- of natriumoxalaat, citraat of polyfosfaat. 



   Het gewichtsrendement van di-en tripeptiden is ongeveer 18 tot 19 % ten opzichte van de gedroogde materie van het slachtingsbloed en 50 tot 56   % ten   opzichte van de droge materie van het plasma. 



   Deze bijzonderheden en andere bijzonderheden en details van de uitvinding zullen worden toegelicht in de volgende gedetailleerde beschrijving. 



   Het bloed bestaat uit een vloeistof, het plasma, in hetwelk typische elementen voorkomen, zoals rode bloedlichamen of hemacyten, leukocyten of witte bloedlichamen en de bloedplaatjes. Na toevoeging van het anticoagulens laat de centrifugatie toe om enerzijds het plasma (60 tot 65 % in volume), anderzijds de typische elementen die de cruor samenstellen (35 tot 40   %   in volume) op te vangen. 



   Het dierlijk bloedplasma bevat per liter 50 tot 75 g eiwitten terwijl melk er slechts 35 g bevat. 



   De eiwitten zijn in hoofdzaak albumine (45 tot 50 % in gewicht) en de globulinen. Het plasma bevat ook vetten, suikers, aminozuren en minerale zouten in oplossing. De tabel hieronder laat toe de samenstelling van het bloedserum (gedefibrineerd plasma) met dat van melk (tabel 1) te vergelijken. 

 <Desc/Clms Page number 7> 

 



    TABEL l    VERGELIJKENDE SAMENSTELLINGEN VAN SERUM EN VAN MELK 
 EMI7.1 
 
<tb> 
<tb> PER <SEP> LITER <SEP> BLOEDSERUM <SEP> MELK
<tb> Protiden <SEP> 70 <SEP> tot <SEP> 80 <SEP> g <SEP> 34 <SEP> g
<tb> Lipiden <SEP> 5 <SEP> tot <SEP> 6 <SEP> g <SEP> 35 <SEP> g
<tb> Gluciden <SEP> 1 <SEP> g <SEP> 49 <SEP> g
<tb> Minerale <SEP> zouten <SEP> 8 <SEP> tot <SEP> 9 <SEP> g <SEP> 9 <SEP> g
<tb> Andere <SEP> substanties <SEP> 2 <SEP> tot <SEP> 3 <SEP> g <SEP> sporen
<tb> Totale <SEP> droge <SEP> materie <SEP> 86 <SEP> tot <SEP> 99 <SEP> g <SEP> 127 <SEP> g
<tb> 
 
Het proces voor de bereiding van een samenstelling volgens de uitvinding uitgaande van slachtingsbloed, bevat de volgende vier essentiële   stappen :

      1. het voorbereiden van het dierlijk bloedplasma 2. de enzymatische hydrolyse 3. de extractie en de zuivering van een fraktie, rijk aan di-en tripeptiden 4. de sterilisatie en de droging van het mengsel van di-en tripeptiden. 



  1. DE VOORBEREIDING VAN HET DIERLIJK BLOEDPLASMA 
Het totale slachtingsbloed wordt opgevangen in aanwezigheid van anticoagulens in het slachthuis. 



  Men voegt hoogstens 4   g/l   kalium- of natriumoxalaat, citraat of polyfosfaat toe. Dit bloed wordt vervolgens gecentrifugeerd. 

 <Desc/Clms Page number 8> 

 



   Het aldus bekomen plasma wordt hetzij onmiddellijk gebruikt, hetzij onmiddellijk ingevroren of gedroogd om het te bewaren met het oog op een later gebruik. 



   De aminozuursamenstelling van rundsplasma is weergegeven in tabel 2. 

 <Desc/Clms Page number 9> 

 



   TABEL 2 AMINOZUURSAMENSTELLING VAN THERMO-GECOAGULEERD RUNDSPLASMA 
 EMI9.1 
 
<tb> 
<tb> AMINOZUREN <SEP> RUNDSPLASMA
<tb> mol <SEP> %
<tb> Arginine <SEP> 4, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Histidine <SEP> niet <SEP> bepaald <SEP> 
<tb> Lysine <SEP> 7,9
<tb> Tyrosine <SEP> 3,1
<tb> Tryptofaan <SEP> niet <SEP> bepaald <SEP> 
<tb> Fenylalanine <SEP> 6, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> Cysteïne <SEP> 2,2
<tb> Methionine <SEP> 0, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> Threonine <SEP> 7, <SEP> 2 <SEP> 
<tb> Serine <SEP> 8,8
<tb> Leucine <SEP> 8, <SEP> 6 <SEP> 
<tb> Isoleucine <SEP> 2,8
<tb> Valine <SEP> 7,2
<tb> Glutamine-zuur <SEP> 10, <SEP> 5 <SEP> 
<tb> Asparagine-zuur <SEP> 8, <SEP> 8 <SEP> 
<tb> Glycine <SEP> 5, <SEP> 9 <SEP> 
<tb> Alanine <SEP> 6,8
<tb> Proline <SEP> 6,

  0
<tb> 
 

 <Desc/Clms Page number 10> 

 
De aminozuursamenstelling van de plasmaeiwitten is gelijkend op die van eiwitten die beschouwd worden evenwichtig te zijn zoals die van melk of van het ei. 



   In het bijzonder, de essentiële aminozuren zoals fenylalanine, lysine, threonine, leucine en valine zijn er vertegenwoordigd in behoorlijke proporties. 



   Het in oplossing gebrachte ingevroren of geatomisserde plasma aan een concentratie van ongeveer 70   g/l   (N x 6, 25), wordt op een pH beneden 6 gesteld en op een temperatuur boven   65    Celsius gebracht. De voorwaarden die leiden tot een maximale neerslag van de plasmatische eiwitten worden weerhouden. 



   Na het verlagen van de pH van het dierlijk plasma tussen 4, 5 en 5 door middel van een sterk voedingstoegelaten zuur (HCl, H2S04, of bij voorkeur H3P04 4 tot 6 N) wordt de temperatuur van de eiwitoplossing verhoogd tot 700 Celsius binnen een tijdsinterval dat 30 minuten niet overschrijdt. Men houdt deze temperatuur gedurende 30 minuten constant en nadien koelt men snel (5 tot 10 minuten) af tot ongeveer   200 Celsius.   Vervolgens recupereert men 95 % aan gewicht van het eiwitstikstof onder de vorm van een coagulaat waarvan de gemiddelde inhoud aan proteinen 160 tot 220 g/kg bedraagt. 



   Bij het verlagen van de pH van het dierlijk plasma, gebruikt men meestal fosforzuur omdat de fosfaationen de eigenschap hebben om een onoplosbare neerslag te vormen met bivalente kationen nl. diegene 

 <Desc/Clms Page number 11> 

 aangebracht door de basen (Ca (OH) 2) die gebruikt worden bij de enzymatische hydrolyse. 



   Op die manier is het mogelijk het calciumgehalte in het eindprodukt op een beduidende manier te verlagen, dankzij het gebruik van fosforzuur tijdens de bereiding van het substraat bij de voorafgaande stap. De noodzakelijke thermische overgangen voor een optimale thermocoagulatie zijn weergegeven in de grafiek figuur 1. 



   Na thermische behandeling wordt het bloedplasma onderworpen aan een vloeistof-vaste stof scheiding. 



   De vloeistof-vaste stof scheiding wordt verwezenlijkt door tangentiële microfiltratie, centrifugatie of filtratie op persfilter. Heden geeft de filtratie op persfilter met platen de beste resultaten. 



   Deze thermische behandeling gevolgd door een vloeistofvaste stof scheiding geeft de volgende voordelen : - verhoging van de toegankelijkheid van het substraat tot het enzyme ; vernietiging van het grootste deel van de protease-inhibitoren ; betekenisvolle verlaging van de besmettelijke mesofiele flora ; uitschakeling van vrije aminozuren en andere kleine   niet-proteine-molekulen   (vetten, suikers,   ureum  ..) ;   en 

 <Desc/Clms Page number 12> 

 vermindering van de ionische kracht van de eiwitsubstraatoplossing na uitschakeling van de ionen tijdens de vloeistof-vaste stof scheiding door filtratie of centrifugatie. 



   Het proteinecoagulaat, gedeeltelijk ontzout, wordt onmiddellijk gebruikt in een enzymatische reaktor of bewaard in de diepvriezer   bij-20    Celsius. 



  2. ENZYMATISCHE HYDROLYSE A. De keuze van het enzyme (protease) 
De hydrolyse reactie gebeurt optimaal voor elke protease dat toelaat een oplosbaarheidsgehalte van plasmapeptiden van meer dan 90 % te bekomen in een zuur milieu (de verhouding van zuur oplosbare eiwitten in trichloor azijnzuur van 100 g/l op totaal aan eiwitten onderworpen aan hydrolyse) evenals een inhoud aan di-en tripeptiden van minstens 75   % van   het totaal aan aminozuren. 



   De meest geschikte proteasen zijn deze van het type serine-proteinase, de alkalische proteinase en die afkomstig van Bacillus licheniformis waarvan het subtilisine van Carlsberg (EC 3.4. 4.16) het hoofdbestanddeel is. 



   Bij wijze van voorbeeld, kunnen de industriële proteolytische enzymen Alkalase 2,4, 1 (NOVO R) of Pescalase 560 (GIST BROCADES R) gekozen worden. 

 <Desc/Clms Page number 13> 

 



   De hydrolyse reaktie van het rundsplasma met Alkalase R (NOVO) of Pescalase R (GIST BROCADES) geschiedt optimaal bij pH-waarden tussen 7 en 9, bij voorkeur tussen 7, 0 en   7, 5.   



   Bovendien zijn bij deze   pH-waarden,   die dicht bij de neutrale waarde liggen, de hoeveelheden base, noodzakelijk voor het behoud van de pH gedurende de proteolyse ronduit minder belangrijk dan bij alkalische pH (8 tot 9). Deze opmerking is zeker 
 EMI13.1 
 niet te verwaarlozen in de mate dat de verwijdering''" van de ionen, op het einde van het proces, moeilijk is. 



   Bij de hydrolyse reaktie kunnen de gebruikte basen voor het behoud van de pH zeer verscheiden zijn (KOH,   Ca (OH) 2, NaOH   enz... ). Teneinde de ionische sterkte in het produkt voortvloeiend uit de hydrolyse te beperken, zal voor de controle en het behoud van de pH, kalk (Ca (OH) 2) gewoonlijk als base gekozen worden. 



   De meest geschikte reaktietemperaturen liggen tussen 50 tot   60    Celsius, om op die manier de proteolyse snel te laten gebeuren en de denaturatie van het enzyme zo miniem mogelijk te houden. 



   Echter, de keuze van een temperatuur van 600 Celsius laat toe de reaktietijd te verlagen (5 uren in plaats van 9 uren aan   500 Celsius)   en de vermenigvuldiging van de bacteriën op een betekenisvolle manier te beperken tijdens de hydrolyse. 



   De combinatie van een neutrale   pH,   of dicht bij de neutrale waarde (7 tot 7, 5) en van een 

 <Desc/Clms Page number 14> 

 temperatuur tussen 50 tot   60    Celsius laat toe een gehalte hoger dan 90 % aan oplosbare plasmatische eiwitten in zuur milieu en een gehalte van tenminste 75 % aan di-en tripeptiden te bekomen bij reaktietijden variërend tussen 5 tot 9 uren en dit wanneer de proteasen die gebruikt worden hetzij Alcalase R   (NOVO),   hetzij Pescalase R (GIST BROCADES) zijn. 



   De gewichtsverhouding is bepaald door de volgende   vergelijking :   Massa enzyme E   ------------------   x   100 =------in %   Massa eiwitsubstraat S waarbij de enzyme massa gelijk is aan de massa industriële bereiding van Alcalase of Pescalase die toegevoegd wordt aan het reaktiemilieu. 



  De substraatmassa is gelijk aan de massa van de plasmatische eiwitten toegevoegd aan de reaktor. Zij wordt gemeten met de Kjeldhal methode (hoeveelheid elementaire stikstof x   6, 25).   



   De gewichtsverhouding van de   respectievelijke   concentraties aan enzymen en aan eiwitsubstraat is tussen 1 tot 4 %. 



   Daarenboven moet de concentratie aan eiwitsubstraat in de reaktor zo hoog mogelijk zijn, maar eveneens een goede   homogeniteit   van het milieu waarborgen. 



   Bij wijze van voorbeeld, een verhouding E/S van 2 % en een concentratie aan substraat van 

 <Desc/Clms Page number 15> 

 ongeveer 90 g/l lijken optimaal. 



  B. De vernietiging van het enzyme 
Wanneer de   proteolysereaktie   beschouwd wordt als afgelopen, gaat men over tot de vernietiging van het enzyme door de pH te verlagen tot   5, 5 à 6, 5   door toevoeging van een voedingstoegelaten sterk zuur   (HCl,   H2S04,   H3P04...)   bij voorkeur   H3P04.   



   De combinatie van een   pH-verlaging   van het milieu met een temperatuursverhoging is de beste. 



   Men verhoogt de temperatuur zeer snel (in 10 tot 20 minuten) tot   75 - 800   Celsius, daaarna behoudt men deze temperatuur gedurende 5 tot 30 minuten. Na deze thermische behandeling, wordt de temperatuur van het milieu zeer snel verlaagd tot   15 - 200   Celsius. 



   Bij voorkeur verlaagd men de pH tot 6, 5 en behoudt men gedurende 20 minuten een temperatuur van   80    Celsius. De bijzondere werkcondities laten een complete vernietiging van het protease toe zonder dat enig spoor van activiteit ontdekt wordt door de referentietesten, terwijl de vorming van toxische derivaten zoals lysinoalanine vermeden wordt. 



  3. ZUIVERING VAN HET HYDROLYSAAT RIJK AAN DI- EN TRIPEPTIDEN A. Het klaren 
Na de enzymatische hydrolyse van het dierlijk plasma, onderwerpt men het reaktiemilieu aan een klaring hetzij door centrifugatie hetzij door 

 <Desc/Clms Page number 16> 

 filtratie (tangentiële microfiltratie, filtratie op persfilter... ), teneinde de onoplosbare eiwitresten, alsook de plasmatische lipidedeeltjes en het mineraal neerslag zoals de calciumfosfaten te verwijderen. 



   Men gebruikt bv. een persfilter met platen in aanwezigheid van filtratiehulpmiddelen van het type diatomite (Spendalite N) aan een concentratie van 30 tot 50 g/kg. 



  B. Ultrafiltratie 
Het door filtratie geklaard hydrolysaat wordt onderworpen aan ultrafiltratie door middel van organische membranen (Polysulfone) opgesteld volgens holle vezels    (Amicon ),   als vlakken    (Millipore )   of 
 EMI16.1 
 R R spiralen -AmiconR) of door middel van minerale membranen (keramische) opgesteld volgens multikanalen (Tech Sep). De eiwitfractie, opgevangen in de ultrafiltratie, bevat de verrijkte samenstelling aan di-en tripeptiden. Het filtratiebereik van de membranen moet tussen de 1. 000 tot   10. 000 liggen.   



  4. STERILISERENDE FILTRATIE EN DROGEN VAN DE SAMENSTELLING RIJK AAN DI- EN TRIPEPTIDEN (DTP) 
Het mengsel rijk aan di-en tripeptiden bekomen door ultrafiltratie, wordt in een zo kort mogelijke termijn (de bewaring in de koelkast aan   4    Celsius mag de 24 uren niet overschrijden) onderworpen aan een steriliserende filtratie met als doel al de besmettelijke bacteriën uit het mengsel te verwijderen. 

 <Desc/Clms Page number 17> 

 



   Daartoe mogen de filtreringsystemen van het type Millipore,   Sartorius... gebruikt   worden. 



   Daar de filtratie-eigenschappen van het produkt zeer goed zijn, is het filtersysteem eenvoudig : - een voorfilter van 2. tot 0, 65 micron - een totale filter van 0, 22 micron. 



   Het gefiltreerd produkt wordt opgevangen in een steriel vat vooraleer het onderworpen wordt aan een   dehydratie ;   het water kan verwijderd worden hetzij door lyofilisatie hetzij door atomisatie al of niet gekoppeld aan een preconcentratie door vacuümindamping. 



   Bijvoorbeeld, het verrijkte mengsel aan dien tripeptiden met aanvankelijk 8 % aan droge materie, wordt dor atomisatie op NIRO ATOMIZER, type kleine produktie, gedroogd waarbij het voedingsdebiet gefixeerd is op 12 1 per uur en de ingangstemperatuur 
 EMI17.1 
 180"Celsius is en de uitgangstemperatuur geregeld wordt op 80 0 Celsius. De droge materie van het verkregen poeder is 94 tot 96   %.   



   De scheiding en de telling van de peptiden op basis van het aantal residuele bestandsaminozuren hetgeen onvermijdelijk een moeilijk op te lossen probleem is, werd opgelost door het gebruik van een recente techniek "Ligand exchange-high performance liquid chromatography" (LE-HPLC). 



   De gelpermeatie chromatografie is een techniek waarbij men molekulen scheidt op basis van 

 <Desc/Clms Page number 18> 

 hun molekulaire grootte. De kleine peptiden worden echter met deze techniek niet gescheiden op basis van hun massa, omdat de elutiezones van di-en tripeptides met verschillende massa's overlappen, hetgeen nl. afhankelijk is van het bestaan van multipele interacties peptiden/gel. Te meer omwille van de bedekking van massadomeinen met families van verschillende afmetingen, laat de moleculaire massadistributie niet toe om een complex mengsel aan kleine peptiden te karakteriseren op basis van hun afmeting. Voor al deze redenen wordt de telling van de di-en tripeptiden in het algemeen niet correct gedaan. 



   Door het op punt te stellen van de techniek LE-HPLC op koperbedekt silicium gekoppeld aan de chemische degradatie van Edman, kon een directe dosering van de aminozuren en van de niet-basische dipeptiden en een indirecte dosering van de tripeptiden uitgevoerd worden. De telling van de aminozuren van niet-basische dipeptiden'en van peptiden met grotere afmeting wordt gerealiseerd door fluorescentie spectrometrie na reductie tot aminozuren. 



   Het bekomen enzymatisch hydrolysaat doet zich voor onder de vorm van een wit poeder met zoete en aangename smaak met de volgende samenstelling : - minimum 75 gewichts% in di-en tripeptiden - minder dan 5 gewichts% in vrije aminozuren, en - minder dan 20 gewichts% in oligo-peptiden groter dan drie aminozuren, de gemiddelde ketenlengte is ongeveer 6, 2 aminozuren. 

 <Desc/Clms Page number 19> 

 



   De droge materie van het verkregen poeder op het einde van de bereiding is 94 tot 96 %.

Claims

CONCLUSIES 1. Werkwijze voor het bereiden van een enzymatisch hydrolysaat dat di-en tripeptiden bevat, uitgaande van een mengsel van dierlijke plasmatische eiwitten, met behulp van proteolytische enzymen, met het kenmerk, dat men het bovengenoemd mengsel van eiwitten bereidt door thermocoagulatie en vloeistofvaste stof scheiding ; men onderwerpt dit mengsel aan een enzymatische hydrolyse om meer dan 50 % in gewicht aan eiwitten om te zetten in di-en tripeptiden men extraheert het hydrolysaat door een vloeistof-vaste stof scheiding : vervolgens verrijkt men het aan di-en tripeptiden door ultrafiltratie vooraleer het te onderwerpen aan sterilisatie en droging.
2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat het bereiden van het oorspronkelijk mengsel gerealiseerd wordt door toevoeging van minder dan 4 g/l anticoagulens aan het slachtingsbloed en dat het mengsel onderworpen wordt aan een centrifugatie teneinde een produkt te bekomen dat aanstonds kan gebruikt worden of dat geschikt is voor het bewaren door invriezing of droging door atomisatie ;

men onderwerpt het alzo verkregen bloedplasma, na aanzuring, aan een thermische behandeling in een temperatuursinterval tussen 70 tot 80 0 Celsius gedurende 30 tot 45 minuten en vervolgens aan een vloeistof-vaste stof scheiding <Desc/Clms Page number 21> door tangentiële microfiltratie of centrifugatie (bij voorkeur filtratie op persfilter met platen) om een vast substraat te bekomen dat onderworpen mag worden aan de hydrolyse in aanwezigheid van proteolytische enzymen, na het terug in suspensie te hebben gebracht.
3. Werkwijze volgens conclusie 1 of 2, met het kenmerk, dat het bloedplasma, bereid door thermocoagulatie om de proteolyse snelheid te verhogen, gehydrolyseerd wordt aan pH-waarden tussen 7 en 9, bij voorkeur tussen 7, 0 en 7, 5 in aanwezigheid van subtilisine bij temperaturen gelegen tussen 50 en 60 Celsius gedurende 5 tot 9 uren.
4. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat het anticoagulens kalium- of natriumoxalaat, citraat of polyfosfaat is.
5. Werkwijze volgens eender welke vorige conclusie, met het kenmerk, dat men overgaat tot de vernietiging van het enzyme wanneer de hydrolyse reaktie beschouwd wordt als afgelopen, door de pH te verlagen tussen 5, 5 tot 6, 5 door toevoeging van een sterk voedingsgeschikt zuur (HC1, H2S04, H3P04) bij voorkeur H3P04, bij een temperatuur begrepen tussen 70 en 80 Celsius gedurende 5 tot 45 minuten.
6. Werkwijze volgens eender welke vorige conclusie, met het kenmerk, dat men het eiwitmengsel, voorbereid door thermocoagulatie op drukfilter met platen, filtreert om de vrije aminozuren en andere molekulen van het niet-proteine type met laag molekulair gewicht (lipiden, suikers, ureum) te verwijderen en een mengsel van di-en tripeptiden te <Desc/Clms Page number 22> bekomen dat een laag gehalte aan vrije aminozuren heeft en een zwakke ionische sterkte.
7. Werkwijze volgens eender welke vorige conclusie uitgaande van het plasma van slachtingsbloed, met het kenmerk, dat het zich vertoont onder de vorm van een poederachtige witte massa met een zoete en aangename smaak bevattend : - ten minste 75 gewichts % aan di-en tripeptiden, - minder dan 5 gewichts% aan vrije aminozuren, - minder dan 20 gewichts% aan grotere peptiden dan drie aminozuren en met een gemiddelde lengte van ongeveer 6, 2.