Polimerasaren kate-erreakzioa

Irudian PCRaren lehenengo 4 zikloak agertzen dira

Polimerasaren kate-erreakzioa, PCR ere deitua (ingelesatik: polymerase chain reaction) biologia molekularrean erabilitako teknika bat da, DNAren zati batetik abiatuta DNA horren milioika kopia egiten dituena. Hasierako DNA kopurua oso txikia izan arren (molekula bakarra, esaterako), PCRaren bitartez molekulen kopurua izugarri ugaritzen da, gene jakinen baten kopia asko lortuz, klonatzeko edo sekuentziatzeko.

Teknika Kary Mullis estatubatuarrak asmatu zuen 1983an. Aurkikuntza honegatik Kimikako Nobel Saria eman zioten 1993an.

Erabilera

PCRak DNA ugaritzen du. DNA identifikatzeko molekula horren kopuru handiak behar direnez, PCRari esker askoz errazagoa da gaixotasunak eragiten dituzten birus edo bakterioak identifikatzea. Ohikoa da ospitaletako laborategietan, adibidez, GIBaren bilaketa edo SARS-CoV-2rena (lagin klinikoetan) PCRren bidez.

Tresna honen beste aplikazio batzuk aipa daitezke:

Medikuntza legalean, pertsonak identifikatzeko oso lagungarria da (kriminalak, lapurrak, hilotzak...). Aitatasun-frogetan ere erabiltzen da.
Ikerketa zientifikoetan, ugaritutako DNA zientzialarien eskura jartzen du.
Genetika molekularrean, geneen analisia erraztu eta herentziazko gaitzen diagnostikoan laguntzen du.
Paleontologian eta antropologian PCRak eskeleto, momia edo fosil batean hondatu ez diren ADNaren puska txikiak berreskuratu eta ugaritzen ditu, laginaren ikerketan asko laguntzen duena.
2020ko COVID-19 pandemian, PCR test berezituak bihurtu dira gaitza detektatzeko giltzarria^[1].

Oinarriak

PCRan DNA polimerasa entzima erabiltzen da, ADNaren erreplikazioan parte hartzen duen entzima, hain zuzen ere. Entzima honek DNA molekulak kopiatzen ditu.

Ziklo termiko desberdinak erabiltzen ditu tresna honek: tenperatura altuko eta baxuko zikloak, alegia. Tenperatura altuko zikloak DNA desnaturalizatzen du, hots, erreplikazio fase bakoitzean sortu diren bi harizpiak banantzen ditu; gero, tenperatura baxuko zikloetan polimerasek harizpi horiek bikoizten dituzte berriz.

Hasiera batean Escherichia Coli bakterioaren DNA polimerasa erabiltzen zen DNA erreplikatzeko, baina arazoak gertatzen ziren: tenperatura altuko zikloetan bakterioaren polimerasa ere desnaturalizatu egiten zen, eta ziklo bakoitzean gehitu behar zen. Hori ekiditeko DNA polimerasa termoegonkorra erabiltzen hasi zen: Thermus aquaticus bakterio termofilotik lortutakoa, ziklo ugari desnaturalizatu gabe jasaten dituena.

PCRaren faseak

PCRa oso teknika eraginkorra da, ordu gutxi batzuetan gene baten edo DNAren puska baten milioika kopia egiten baititu. Teknika honek etengabeko zikloetan burutzen da, eta ziklo bakoitzean produktuaren kopurua bikoiztu egiten da.

Ziklo batek hiru etapa edo fase ditu, fase bakoitzean tenperatura bat erabiltzen delarik. Termoziklagailu izeneko tresna batean burutzen da: bertan sartzen dira DNA duten saio hodi txikiak, eta gailu horrek fase bakoitzak behar duen tenperatura sortzen du.

Zikloaren hiru etapak honako hauek dira:

Desnaturalizazioa: 95 °C-tan gertatzen da. Tenperatura horretan DNAren bi harizpiak banandu egiten dira.
Hibridazioa: fase honetan tenperatura 55-65 °C ingurura jaisten da. Berebiziko garrantzia dute etapa honetan "primers" edo abiarazle deitutakoak, DNAren harizpi bakoitzaren 3´ muturrari atxikitzen direnak. Abiarazle horiek beharrezkoak dira DNA polimerasa entzimak bere lana has dezan (abiarazlerik ezean DNA ez baita erreplikatzen). Abiarazleek 20 nukleotido inguru dute, zati laburrak dira, baina oso garrantzitsuak: DNAren kate-moldera atxikitzen dira haien baseak katearen osagarriak direlako, eta honek ugaldu nahi diren DNA-zatiak aukeratzea ahalbidetzen du.
Elongazioa: 72 °C-tan burutzen da. DNA polimerasak kate berriak kopiatzen ditu, kate edo harizpi zaharrak molde gisa jarduten duelarik. Kate berriaren norabidea 5'→ 3' da, eta bera sintetizatzeko DNA polimerasak inguruan dauden nukleotidoak erabiltzen ditu.

Kontuan hartu behar da abiarazle batekin sortzen den harizpi berriak beste abiarazle baten molde gisa jokatuko duela hurrengo zikloan.

Lehenengo zikloa bukatutakoan hasierako DNA zatiaren 2 kopia izango dira. Bigarren zikloa bukatutakoan 4 kopia izanen dira, eta 3. zikloaren bukaeran 8. Hots, ziklo bakoitzean DNAren kopiak bikoiztu egiten dira.

PCRa bukatutakoan, sortutako DNA-kopiak elektroforesiaren bitartez analizatzen dira, eta patroi batzuekin konparatu. Adibidez, birus edo bakterioen identifikazioan mikrobio horien gene zehatzak bilatzen dira. PCRaren bitartez gene horiek ugaritzen dira, eta elektroforesiaren bidez antzeman, patroiekin konparatuz.